Введение
Есть только единичные исследования, подтверждающие феномен стимуляции синтеза коллагена после введения в кожу гиалуроновой кислоты (Wang et al., 2007). В этом пилотном исследовании выдвинута гипотеза, объясняющая активизацию неоколлагенеза механическим фактором - натяжением волокон коллагена под действием введенного материала с последующим растяжением фибробластов, связанных с этими волокнами. Фибробласты вытянутой формы становятся метаболически активными и приступают к синтезу коллагена и гликозамигликанов. Одновременно устанавливается равновесие между ферментами разрушающими коллаген - матриксными металлопротеиназами (ММП) и их тканевыми ингибиторами (ТИМП).
(нажмите для увеличения)
Цели исследования
- - Оценить процессы синтеза и деградации коллагена после инъекции филлера Glytone 3
- - Изучить метаболический ответ на инъекцию филлера Glytone 3 у пациентов двух возрастных групп: 35-45 лет и 65-75 лет.
Методы
Шестьдесят (60) добровольцев были рандомизированы в три группы по 20 человек в каждой: за участниками первой группы наблюдали в течение месяца, второй - в течение 3 месяцев, третьей - шести месяцев после инъекции. Каждая группа была разделена на две подгруппы по 10 человек: в возрасте 35-45 лет (подгруппа 1) и 65-75 лет (подгруппа 2). В начале исследования всем участникам был введен препарат Glytone 3 (0,5 мл) в кожу внутренней части одного плеча (экспериментальная область), одновременно вводили 0,5 мл физиологического раствора натрия хлорида в аналогичную область другого плеча (контрольная область) в соответствии с листом рандомизации.
(нажмите для увеличения)
60 УЧАСТНИКОВ |
ИССЛЕДОВАНИЯ, СРОКИ |
Группа 1 |
ТО, Т1 месяц |
Группа 2 |
ТО, Т3 месяца |
Группа 3 |
ТО, Т6 месяцев |
Отбор и анализ биопсийных материалов
У всех участников исследования образцы кожи (биопсия) забирались в контрольной области в начале исследования (ТО), затем на сроках Т1 месяц, ТЗ месяца и Т6 месяцев из экспериментальной и контрольной областей. Во всех образцах проводили количественный анализ различных биомаркеров (см. таблица 1).
(нажмите для увеличения)
Таблица 1:
Маркеры |
Содержание в коже (иммуноферментный анализ ELISA) |
Экспрессия генов (полимеразная цепная реакция, ПЦР) |
|
Проколлаген |
Коллаген 1А1, коллаген 1А2, коллаген ЗА1 |
Матриксные металло- протеиназы (ММП) |
ММРЗ, ММР9 |
. ММРЗ, ММР9 |
|
TIMP1, 2 and 3 |
TIMP1, 2 and 3 |
Результаты
Иммуноферментный анализ (ELISA) белковых маркеров
Уровень различных биохимических маркеров состояния дермального матрикса перед началом исследования был одинаков в разных группах. Через месяц после инъекции наблюдалось существенное повышения уровня проколлагена в зкспериментальных (+138%) и контрольных существенное повышение уровня проколлагена областях (+44%) по сравнению с базовыми показателями (р=0,0016). Результаты были исходно подсчитаны для всех участников исследования (FAS - full analysis set), а затем и по группам/подруппам (PP – protocol population). Значительное повышение уровня проколлагена в эксперементальных облостях- на 33% по сравнению с исходными показателями (р=0,0253) было показано на сроке 3 месяца.
В это же время уровень коллагена в контрольных областях незначительно отличался от исходного (+12,7%). Однако межгрупповой анализ не выявил достоверной разницы между экспериментальными и контрольными областями (р=0,1277) (рис. 1). Максимальная разница отмечалась в отдельных подгруппах по сравнению с интегральным показателем (р=0,0005).
Аналогичная тенденция на сроке 1 месяц наблюдалась и для такого показателя как уровень тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ (ТИМП): в экспериментальных областях их содержание повысилось на 28% (p=0,0086). Повышение уровня ТИМП в контрольных областях (+8%) не было статистически значимым. Разница между двумя областями была существенной (р=0,0485). Однако через 6 месяцев наблюдалась обратная ситуация: уровень ТИМП был выше исходного на 12% в контрольных областях (p=0,0488) и всего на 4% в экспериментальных (рис. 2). При повторном анализе существенных различий между разными областями не обнаружили.
ПЦР-анализ экспрессии белковых маркеров
Количественный анализ маркеров с помощью метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR) представил дополнительные доказательства в пользу того, что инъекции гиалуроновой кислоты способствуют синтезу проколлагена через экспрессию соответствующего гена, подтвердив таким образом результаты иммуноферментного анализа. Через месяц после инъекции существенно возросла экспрессия двух изоформ коллагена 1 типа (р=0,007 и р=0,0057, соответственно), а также коллагена 3 типа (р=0,004) в экспериментальных областях (Glytone 3) по сравнению с контрольными (физиологический раствор) (таблица 2, рис. 3). Этот
стимулирующий эффект снижался во времени.
Однако и через 3 месяца после инъекции Glytone 3 экспрессия изоформ коллагена 1 типа (А1 и А2), а также коллагена 3 типавсе еще достоверно превышала исходный уровень (p=0,0266 и 0,0086 для изоформ коллагена 1 типа и р=0,0126 для коллагена 3 типа).
Межгрупповой анализ не выявил существенных различий в экспрессии мессенджеров синтеза коллагена между экспериментальной и контрольной областями, в то время как результаты анализа на сроке 3 месяца в различных возрастных группах показали увеличение экспрессии коллагена типов 1А1, 1А2 и 3 в экспериментальных областях по сравнению с исходным уровнем у участников исследования в возрасте 65-75 лет (р=0,0483; 0,0104 и 0,0229, соответственно). В контрольных областях выявленная разница было несущественной. У участников в возрасте 35-45 лет экспрессия коллагена разных типов через 3 месяца после инъекции Glytone 3 незначительно отличалась от базового уровня (таблица 2).
Экспрессия ТИМП 1через месяц после инъекции была повышенной и в экспериментальных, и в контрольных областях. Различия между областями были статистически достоверными (p=0,0135) (таблица 2). В отношении ТИМП 2 и 3 разница в экспрессии на протяжении 3 месяцев наблюдалась только в старшей возрастной группе.
Обсуждение
Проведенный литературный поиск показал, что есть только одна публикация, подтверждающая? эффект неоколлагенеза в ответ на введение гиалуроновой кислоты (Wang et al., 2007). Данные, i полученные Wang, совпадают с результатами приведенного исследования, показывающими, что инъекции филлера Glytone 3 запускают процесс синтеза коллагена, что подтверждается повы-] шением уровня проколлагена, коллагена 1 типа и трех показателей мРНК. Этот эффект обнаруживается через месяц после инъекции и продолжается на протяжении 3 месяцев.
Параллельно наблюдается и другой процесс: через месяц после инъекции фиксируется значительное повышение как экспрессии гена, так и собственно уровня тканевых ингибиторов матриксных протеиназ (ТИМП 1). Повышение уровня ТИМП 1 в контрольных областях через 6 месяцев после инъекции может быть связано с системной ошибкой межгруппового анализа, поскольку повышения экспрессии соответствующего гена на этом же сроке не наблюдается, j В заключение хочется отметить, что полученные результата подтверждают гипотезы Fisher и Voorhees (Fisher et al., 2008) и проливают свет на механические эффекты, которые способству- - ют изменению метаболических процессов в дерме после инъекции гиалуроновой кислоты. К биохимическим показателям, которые чувствительны к подобному механическому воздействию, относятся как уровень собственно коллагена разных типов, так и уровень тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ (ТИМП), регулирующих метаболизм коллагена. ТИМП подавляют активность ферментов, разрушающих коллаген, таким образом, они выступают как модуляторы гиперактивного катаболизма.
Наконец, полученные результаты показали, что у пожилых людей наблюдается более актив-! ная реакция на инъекции гиалуроновой кислоты (Glytone 3), что подтверждается более активной экспрессией метаболических факторов (ТИМП 1) в течение 3 месяцев после инъекции.
Рисунок 1: Динамика изменения уровня проколлагена после инъекции филлера Glytone 3
(нажмите для увеличения)
Рисунок 2: Динамика изменения уровня ТИМП 1 после инъекции филлера Glytone 3
(нажмите для увеличения)
Таблица 2: Динамика экспрессия генов коллагена и ТИМП
(нажмите для увеличения)
Таблица 3: Динамика экспрессии генов коллагена и ТИМП в разных возрастных группах на сроках исследования
(нажмите для увеличения)
